ارسای داخل کشور دکتری تخصصی (PhD) 1401
پدیدآور: احمد نوروزیان 
استاد راهنما: علی اعلمی
دانشگاه گیلان، پردیس دانشگاهی
چکیده

یکی از مهم‌ترین عوامل تأثیرگذار در میزان متابولیت‌های ثانویه گیاهان دارویی، تنش‌های محیطی اعمال شده بر آنها است. خشکی از مهم‌ترین تنش‌های محیطی است که حدود 25 درصد از تولید زمین‌های جهان را با محدودیت شدید مواجه و اثرات بسیار نامطلوبی بر رشد و عملکرد گیاهان می‌گذارد. با وجود مطالعات گسترده‌ای که در مورد اثر تنش آبی و خشکی بر رشد و عملکرد گیاهان زراعی انجام شده، اما در مورد پاسخ متابولیکی به این تنش‌ها در گونه‌های دارویی و رفتار آن‌ها در شرایط تنش خشکی به ویژه از جنبه مولکولی، مطالعات کافی وجود ندارد. گیاه دارویی کَوَر (Capparis spinosa L.) گیاهی چند منظوره‌ است که علی‌رغم برخورداری از ارزش‌های غذایی، دارویی، درمانی، اقتصادی و زیست محیطی بسیار و با دارا بودن متابولیت‌های ارزشمندی هم‌چون روتین و کوئرستین، به خوبی مورد توجه قرار نگرفته است. این مطالعه با هدف بررسی بیان ژن‌های کلیدی مسیر بیوسنتزی روتین و کوئرستین در گیاه کَوَر در شرایط تنش خشکی و در محیط گلخانه، در قالب طرح کاملا تصادفی با چهار تیمار تنش خشکی ملایم (75درصد)، متوسط (50درصد)، شدید (25درصد) و بدون تنش (100درصد) ظرفیت زراعی به عنوان شاهد انجام شد. در ابتدا خواب بذرهای کَوَر اکوتیپ تفرش تحت تیمارهای اسیدشویی (اسید سولفوریک غلیظ در زمان‌های 15، 30، 45 و 60 دقیقه به همراه تیمار هورمونی اسید جیبرلیک در غلظت‌های 200، 400 و 600 میلی‌گرم در لیتر)، شکسته شد و برخی شاخص‌های مرتبط با جوانه‌زنی (درصد جوانه‌زنی، سرعت جوانه‌زنی و شاخص جوانه‌زنی) ارزیابی گردید. بذرهای جوانه زده در گلدان‌های مناسب کاشته و مراقبت‌های لازم تا استقرار کامل گیاهچه‌ها به عمل آمد. تیمارهای خشکی مورد نظر در مرحله رشد رویشی گیاهچه‌ها و پس از تعیین ظرفیت زراعی خاک، اعمال شد. در این مرحله برخی شاخص‌‌های مورفولوژیکی (طول شاخساره، تعداد و سطح برگ، وزن تر و خشک برگ)، صفات فیزیولوژیکی (محتوای نسبی آب برگ و محتوای آب برگ)، صفات فیتوشیمیایی (محتوای فلاونوئید و پلی‌فنول کل، محتوای فلاونوئید کل بیوماس برگ، درصد مهارکنندگی آنتی اکسیدانی) و هم‌چنین میزان دو متابولیت روتین و کوئرستین در برگ گیاه پس از عصاره‌گیری به روش اسپکتروفتومتری و کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC) اندازه گیری شد. در نهایت مطالعات مولکولی و بررسی بیان ژن‌های اصلی مسیر بیوسنتزی روتین و کوئرستین در برگ گیاه، شامل ژن‌های4CL, F3'H, FLS, RT پس از استخراج RNA کل بافت برگی، مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد کاربرد تیمار ترکیبی اسید سولفوریک غلیظ در زمان 45 دقیقه و اسید جیبرلیک با غلظت 400 میلی‌گرم در لیتر، میانگین درصد جوانه‌زنی بذر کَوَر را به میزان 81درصد افزایش داد و توانست سرعت و شاخص جوانه‌زنی بذر را به ترتیب معادل 3/21 بذر در روز و 10/48 افزایش دهد. اعمال تنش خشکی موجب کاهش معنی‌دار صفات مورفولوژیک طول ساقه، طول و عرض برگ، سطح برگ و تعداد برگ در مقایسه با شاهد گردید. بیش‌ترین رشد طولی شاخساره در تیمار شاهد با میانگین 15 سانتی‌متر و کم‌ترین رشد طولی نیز در تیمار شدید 25درصد با میانگین 4 سانتی‌متر مشاهده شد. هم‌چنین بیش‌ترین تعداد برگ با میانگین 5/9 مربوط به تیمار شاهد و کم‌ترین تعداد برگ نیز با میانگین 3/8 در تیمار 25درصد ملاحظه گردید. شاخص سطح برگ در تیمار 25درصد، با میانگین 65/0 سانتی‌متر مربع در مقایسه با شاهد (4/05 سانتی‌متر مربع)، به میزان 16 برابر کاهش نشان داد. هم‌چنین در میانگین وزن تر و خشک برگ نیز بین تمام تیمارها تفاوت معنی‌داری ملاحظه شد. میانگین وزن تر برگ در تیمار 25 درصد معادل 28 برابر و وزن خشک نیز در همین تیمار معادل 35 برابر نسبت به شاهد کاهش نشان داد. از نظر صفات فیزیولوژیکی RWC و LWC، نیز هرچند بین تیمار 25 درصد و تیمار شاهد تفاوت معنی‌دار وجود داشت، اما بین دو تیمار 50 و 75درصد، تفاوت معنی‌داری ملاحظه نگردید. بیش‌ترین محتوای پلی‌فنول و فلاونوئید کل به ترتیب با میانگین (521/6 و 123/84 میلی‌گرم در گرم وزن خشک) در تیمار 25درصد و کم‌ترین مقدار نیز با میانگین (212/7و 64/28 میلی‌گرم در گرم وزن خشک) در تیمار شاهد ملاحظه گردید. مقدار این ترکیبات در دو تیمار 50 و 75درصد تفاوت معنی‌داری نشان نداد. بیش‌ترین مقدار فلاونوئید کل بیوماس برگ نیز به روش HPLC در تیمار شاهد با میانگین (15377میلی‌گرم) و کم‌ترین این مقدار در تیمار 25درصد با میانگین (10466 میلی‌گرم) ارزیابی شد. تیمار 50 درصد با میانگین12088 میلی‌گرم از نظر مقدار فلاونوئید به تیمار 25درصد و تیمار 75درصد نیز با میانگین 14711میلی‌گرم از نظر مقدار ماده خشک به تیمار شاهد نزدیک بود. بیش‌ترین میزان درصد آنتی اکسیدانی نیز در تیمار شدید خشکی با میانگین 80/89 و کم‌ترین میزان در تیمار شاهد با میانگین 69/06 درصد ملاحظه گردید. تیمار 25درصد با میانگین 2/66 میلی‌گرم در گرم وزن خشک، بیش‌ترین مقدار روتین و تیمار شاهد نیز با میانگین 0/41 میلی‌گرم در گرم وزن خشک، کم‌ترین مقدار روتین را نشان داد. در حالی‌که بیش‌ترین مقدار کوئرستین در تیمار شاهد با میانگین 1/15 میلی‌گرم در گرم وزن خشک و کم‌ترین مقدار نیز با میانگین 0/23 میلی‌گرم در گرم وزن خشک در تیمار 25درصد به‌دست آمد. ارزیابی مقدار این دو ترکیب در بیوماس برگ در تیمارهای مورد بررسی نیز حاکی از وجود بیش‌ترین مقدار مجموع این دو ترکیب در تیمار شاهد با میانگین 370/63 میلی‌گرم بود. کم‌ترین مقدار نیز در تیمار شدید 25درصد با میانگین 243/90 میلی‌گرم ملاحظه گردید. این تفاوت ناشی از بالاتر بودن مقدار وزنی ماده خشک برگی بر اساس شدت تنش بود. نتایج مطالعات مولکولی و بررسی بیان ژن‌های درگیر در مسیر بیوسنتزی دو فلاونوئید در پاسخ به تنش خشکی نیز حاکی از افزایش معنی‌داری بیان ژن‌ها در مقایسه با شاهد بود. بالاترین میزان بیان این 4 ژن در تیمار 50 درصد مشاهده شد. افزایش شدت تنش، منجر به فعال شدن مکانسیم‌های مولکولی و آنزیمی مسیر شده و بیان ژن 4CL، 3/7 برابر شاهد افزایش نشان داد. بیش‌ترین مقدار بیان ژن F3′H نیز با 4/24 برابر شاهد در تیمار 50درصد ملاحظه شد. ژن‌های FLS و RT نیز به ترتیب با 13/05 و 8/61 برابر شاهد بالاترین میزان بیان را در تیمار 50درصد نشان دادند. نتایج نشان داد که مقدار ماده موثره روتین در برگ کَوَر به طور معنی‌داری با تنش خشکی افزایش یافته و الگوهای بیان ژن‌های مرتبط با بیوسنتز آن نیز توسط این تنش تنظیم می‌شود. به‌طور کلی اگر چه بر اساس نتایج حاصل از تحقیق، مقدار ماده موثره (روتین) بیش‌تری در تنش‌های شدیدتر(25%)، تولید می‌گردد، اما در بهره‌برداری اقتصادی و زراعی گیاه کَوَر، میزان بیوماس تولیدی نیز فاکتور تعیین کننده‌ای در استحصال ماده موثره بوده و در اعمال تنش خشکی باید مورد ملاحظه قرار گیرد.